Родился 28 сентября 1923 года в Фонтана Лири недалеко от Неаполя в семье столяра. Детство и юность его прошли в Турине и в Риме. Он окончил техническое училище. Работал чертежником, строителем. Во время войны поступил в Римский университет на строительное отделение. Но серьезное увлечение театром и незаурядные актерские способности позволили студенту Мастроянни играть на сцене университетского театра, а потом попасть в группу Висконти.
Свою первую эпизодическую роль Мастроянни сыграл еще будучи подростком в фильме «Марионетка» (1938).
Настоящим киноактером он стал в конце 40-х годов после съемок в фильмах «Августовское воскресенье», «Париж, всегда Париж», «Девушки с площади Испании». Характерным персонажем для Мастроянни был простой скромный парень - рабочий, таксист, идеальный муж для девушек из простонародья.
Начиная с середины 50-х в манере его игры начинают усиливаться иронические нотки. В «Белых ночах» (1957) Висконти, выступая в ансамбле с Ж. Маре и Марией Шелл, он впервые создает утонченный романтический образ, далекий от своих простоватых героев.
В 1961 году последовали не менее восторженные отклики кинокритиков о работе Мастроянни в фильме М. Антониони «Ночь», где его отрешенная манера исполнения точно соответствовала режиссерской задаче передачи отчуждения, царящего в современном обществе.
Выиграв 2 подряд награды Британской Академии кино, Мастроянни исполнил главную роль в новом шедевре Феллини - «8 1/2» (1963), после чего продюсер Карло Понти привлек его к ряду проектов с участием своей супруги, Софии Лорен. Под руководством Витторио де Сики Мастроянни и Лорен сыграли супругов в «Браке по-итальянски» и в другом популярном фильме «Вчера, сегодня, завтра». Так родился один из самых знаменитых дуэтов мирового кино.
Женщины обожали Марчелло, не давали ему прохода. Целые экскурсионные автобусы, набитые пожилыми американками, каждую неделю подъезжали к его вилле, лишь бы увидеть знаменитого итальянца. Первое время он даже выходил на балкон и махал им рукой. «Я был крайне удивлен их реакцией, - признавался актер, считавший себя не особенно привлекательным. - Ведь я ненавидел себя, свои хилые руки, тоненькие ножки, короткий нос и мясистые губы… и завидовал тонким губам Жана Габена».
Но Марчелло, конечно, кокетничал, ведь пальцев на обеих руках не хватит, чтобы перечислить женщин, которых он обнимал не только на экране. На какое-то время рядом с ним оказывались Урсула Андресс, Жаклин Биссет, Катрин Денев, Фэй Данауэй, Анита Экберг, Настасья Кински, Роми Шнайдер, Софи Лорен, Марта Келлер, Моника Вити. Правда, Софи Лорен всячески открещивалась от любовных отношений с Марчелло: «Он всегда был для меня просто другом, живущим по-соседству. Мы много снимались вместе, я помню каждую нашу работу, фильм за фильмом, кадр за кадром. Думаю, редко в истории всего мирового кино между актерами была такая гармония, как между Марчелло и мной. Но роман - нет, никогда…»
Марчелло тоже не раскрывал секретов взаимоотношений с Лорен. Он вообще не любил распространяться о своих женщинах. «Я никогда не считал женщин - я их только любил! - однажды признался он. - В этой жизни они дали мне любовь. Может быть, я дал им меньше».
Пиком эволюции антигероя для Мастроянни стал Артур Мерсо в Постороннем (Lo straniero, 1967), экранизации романа А. Камю, осуществленной Висконти. Начало 1970-х годов знаменуется расцветом итальянского «политического кино», однако в это время Мастроянни предпочитает сниматься в полных «черного юмора» и сарказма фильмах-притчах М. Феррери Человек с пятью шарами (L’uomo dai cinque palloni, 1970), Сука (La cagna, 1972), Большая жратва (La grand bouffe, 1973), Не прикасайся к белой женщине (Touche pas la femme blanche, 1974), Прощай, самец (Ciao, mashio, 1978). В фильме братьев Тавиани Аллонзанфан (Allonsanfan, 1974) он вновь обращается к образу антигероя, революционера-предателя, а в картине Э.Сколы Особенный день (Una giornata particolare, 1977) раскрывает драму социального аутсайдера.
В отличие от многих других звезд и партнеров Мастроянни (прежде всего Лорен), 1980-е годы приносят ему череду творческих удач. В фильмах Город женщин (La citta delle donne, 1980), Джинджер и Фред (Ginger e Fred, 1985), Интервью (Intervista, 1987) Феллини и Новый мир (Il mondo nuovo) Сколы актер виртуозно проводит тему угасающего ценителя земных радостей. Ролью такого плана стал и персонаж Мастроянни в советско-итальянском фильме Н. Михалкова Очи черные (1986; премия МКФ в Канне, 1987).
В 1990-е годы актер переходит к ролям характерных возрастных героев. Лучшими в этом ряду стали его работы в фильмах Все в порядке (Stanno tutti bene, 1990) Д. Торнаторе, Прерванный шаг аиста (Le pas suspendu de la cigogne, 1991) Т. Ангелопулоса, Готовое платье (Pret-a-porter, 1994) Р. Олтмена. В 1992 вклад Мастроянни в мировое киноискусство был отмечен призами «Оскар» и «Сезар».
Актер был официально женат на итальянской актрисе Ф. Карабелле. Последние 20 лет жизни провел с француженкой А.М. Тато. Объектами его длительных романтических увлечений были актрисы Ф. Данауэй, У. Андресс, К. Денев, от которой у Мастроянни дочь Кьяра, также ставшая киноактрисой. В 1996 отец и дочь появились на экране в фильме Три жизни и одна смерть (Trois vies et une senle mort).
Уже тяжело больным, страдая от рака поджелудочной железы, Мастроянни не прекращал играть, и даже вернулся на театральную сцену, о которой в период бурной кинематографической жизни несколько подзабыл. Его последней ролью в театре стала пьеса «Последние луны», где он играл старого, одинокого человека, к которому приходит призрак его умершей жены. Только для того чтобы выйти к зрителю, Марчелло по утрам проходил изнурительные процедуры химиотерапии. И все равно не утрачивал своего жизнелюбия: «Может быть, я и стал занудой, но все равно смотрю на жизнь с оптимизмом. И синьору с белой бородой там, в небесах, говорю: не обращай на меня внимания, пусть я еще поживу!»
Но у «синьора с белой бородой» был свой сценарий, по которому сердце 72-летнего Марчелло Мастроянни остановилось рано утром 19 декабря 1996 года. В этот момент в его парижском доме рядом с ним была его дорогая Катрин Денев и их дочь Кьяра.